Western Blot 攻略之常见问题详解（二）

其实我们刚刚分享的WesternBlot技术手册已经完美的解释了下面这些问题，但是我还是把一些重要的问题再强调下。...





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其实我们刚刚分享的Western Blot 技术手册已经完美的解释了下面这些问题，但是我还是把一些重要的问题再强调下。

1、想分离的蛋白是分子量200kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？

答：200kd的蛋白不好做， 分离胶用7％，积层胶 3.5％。

2、如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？

答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试1.5mm的。

3、蛋白变性后可以存放多久？

答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。

4、我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？

答：上述提到的两种凝胶均可以使用，因为105KD的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。

5、二抗是生物素化的抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？

解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．

6、问一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？

答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和孵育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。

7、做组织样品的western的时候，怎样处理样品？

答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧 烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ）。

8、问大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？

答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

9、有什么方法可以提高上样量？

答：a)可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量；b)用5倍的上样缓冲液来稀释变性

10、蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

答：上样量要根据实验的要求来定， 如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系， 尽量多上就行了， 但是不要超载.

11、一抗，二抗的比例是否重要？

答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。

12、要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。

13、免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？

答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。

14、Western Blot 中抗体的可以重复应用吗？

答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

15、在做Western Blot时，PVDF膜用甲醇浸泡的目的？

答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

16、检测同一抗体的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一张膜上吗？

答：可以。

17、转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端的转膜好象不是很好，为什么？

答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。

18、做Western Blot时，同样的抗体免疫组化能做出，而Western Blot却不能？

答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和免疫组化。

19、如果是6×8转印膜，要加多少一抗？

答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

20、上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

答：无特殊要求。但我们一般是上槽放新鲜的缓冲液，下槽可以是重复使用过一两次的缓冲液

21、跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？

答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂。

22、蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAGE， 湿转120mA， 45-60min就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－PAGE，200mA 90-120min。

23、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？

答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度），因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）.

24、我用的是可视marker，但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。

答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。

25、是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？

答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。

26、核内抗原Western Blot内参选择什么合适？

答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。

27、做半定量Western Blot，内参β-actin，GAPDH哪个好？

答：选用beta-actin就可以。

28、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？

答：一般来说提取时加入广谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。

29、转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？

答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), NaCl：8g， Tris base：2.42g 加水 800ml溶解, 加 500-1000ul 的 Tween-20, 用HCl 调节pH 至 7.4, 加水定容至 1L.

30、封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如在室温里做，或者要在4度下?

答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。

31、请问一下PVDF膜和硝酸膜结合蛋白的原理是什么？

答：一般而言，硝酸纤维素膜是通过疏水作用来和蛋白质相联，这样的话，反复洗几次后，蛋白容易掉下来，结果较差。PVDF膜主要通过它膜上的正电荷和蛋白接合，同时也有疏水作用，但相对较弱。这样的话，PVDF膜和蛋白接合较牢，不易脱落，结果较好。

32、怎样才能把胶跑的非常漂亮，泳道都能很直，上样的量和灌胶是否很重要，电压有什么要求？

答：影响跑胶跑的质量，有以下几个因素：1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮，浓缩胶55v，分离胶75v就能跑得很好。2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。倒胶之前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，双蒸水隔离时，一定要比较轻地加上去，避免稀释上层的分离胶.

33、为什么提高大分子量蛋白的转移的时候，小分子量蛋白会丢失一些哪?什么原因?

答：小分子的蛋白在转移过程中，会透过膜去，所以大分子的上去以后，有一部分小分子的就透过去了。

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